Quang phổ UV-Vis hoạt động như thế nào

  • 06/12/2023

Quang phổ tia cực tím (UV-Vis) là khái niệm không thể thiếu trong nhiều lĩnh vực khoa học, đặc biệt là trong nuôi cấy vi khuẩn, xác định thuốc, kiểm tra và định lượng độ tinh khiết axit nucleic. Từ việc đảm bảo chất lượng trong ngành công nghiệp đồ uống đến nghiên cứu hóa học, UV-Vis đóng vai trò quan trọng.

Bài viết này EMIN SẼ giới thiệu cách quang phổ UV-Vis hoạt động, đồng thời đưa ra cái nhìn sâu rộng về quá trình phân tích dữ liệu đầu ra. Điều này không chỉ giúp bạn đọc đơn thuần đọc biểu đồ mà còn hiểu rõ về ý nghĩa của mỗi đỉnh sóng và độ hấp thụ, mở ra cánh cửa cho những diễn biến tinh tế của các chất phản ứng trong quang phổ.

UV - VIS là gì ?


Quang phổ UV-Vis là một kỹ thuật phức tạp, làm nổi bật sự quan trọng của việc phân tích lượng bước sóng rời rạc của tia UV và ánh sáng khả kiến. Kỹ thuật này tận dụng sự hấp thụ hoặc truyền qua mẫu, so sánh với mẫu chuẩn hoặc mẫu trắng, để tiềm ẩn những thông tin hữu ích về thành phần và nồng độ của mẫu.

Khi ta nhìn vào đặc tính của ánh sáng, chúng ta bắt đầu với việc hiểu rằng ánh sáng mang theo một lượng năng lượng tỉ lệ nghịch với bước sóng của nó. Bước sóng ngắn hơn mang theo năng lượng cao hơn, trong khi bước sóng dài hơn thì ít năng lượng hơn. Điều này là chìa khóa để giải thích hiện tượng hấp thụ ánh sáng trong quang phổ UV-Vis.

Một điều quan trọng là lượng năng lượng cụ thể cần thiết để đẩy electron lên trạng thái năng lượng cao hơn. Và chính sự khác nhau trong môi trường liên kết của các chất làm cho mỗi chất đòi hỏi một lượng năng lượng khác nhau. Điều này giải thích vì sao hấp thụ ánh sáng xảy ra ở các bước sóng khác nhau, tạo ra quang phổ đa dạng và đặc trưng.

Ánh sáng khả kiến mà con người có thể nhìn thấy nằm trong khoảng từ 380 nm (màu tím) đến 780 nm (màu đỏ). Mặt khác, ánh sáng UV có bước sóng ngắn hơn nhiều, khoảng 100 nm. Điều này mở ra cơ hội đối với quang phổ UV-Vis để định vị các bước sóng cụ thể, một khía cạnh quan trọng trong việc phân tích và xác định các chất khác nhau. Kỹ thuật này không chỉ là một cửa sổ mở ra thế giới tinh tế của mẫu, mà còn là một "công cụ" mạnh mẽ để "đọc" câu chuyện tinh tế của chất liệu dưới ánh sáng tia UV và khả kiến.

Cách hoạt động của quang phổ UV - VIS

Mặc dù có nhiều biến thể trên máy quang phổ UV-Vis, để đạt được cái nhìn rõ ràng hơn về cách máy hoạt động, chúng ta hãy khám phá các thành phần chính, được minh họa trong Hình 1.


Nguồn sáng:

Là một kỹ thuật dựa trên ánh sáng, việc sử dụng một nguồn sáng ổn định có khả năng phát ra ánh sáng trên nhiều bước sóng là quan trọng. Thông thường, đèn xenon được ưa chuộng với cường độ cao, bao gồm cả dải UV và nhìn thấy được. Tuy nhiên, với giá thành cao và sự không ổn định, đèn vonfram và đèn halogen cũng được sử dụng.

Với các thiết bị sử dụng 2 nguồn sáng, thường sử dụng đèn vonfram hoặc halogen cho ánh sáng nhìn thấy, còn đèn đơteri là nguồn cho tia UV. Sự chuyển đổi giữa hai nguồn sáng khác nhau để quét cả tia UV và bước sóng nhìn thấy yêu cầu một quá trình chuyển đổi suôn sẻ, thường xảy ra trong khoảng 300 đến 350 nm.

Lựa chọn bước sóng:

Sau đó, việc chọn bước sóng ánh sáng phù hợp với mẫu và chất phân tích là quan trọng để kiểm tra mẫu từ các bước sóng rộng của nguồn sáng. Các phương pháp hiện có bao gồm máy đơn sắc, bộ lọc hấp thụ, bộ lọc giao thoa, bộ lọc ngắt, và bộ lọc thông dải.

Máy đơn sắc tạo ra dải hẹp có bước sóng, có thể điều chỉnh thông qua cách tử nhiễu xạ, cung cấp độ phân giải tốt hơn khi tần số rãnh cao hơn. Các bộ lọc thường được sử dụng để thu hẹp bước sóng được chọn và cải thiện chất lượng phép đo.

Điều này cho thấy sự linh hoạt của máy quang phổ UV-Vis trong việc lựa chọn nguồn sáng và bước sóng, tạo điều kiện cho các phép đo chính xác và đáng tin cậy trong nhiều ứng dụng.

Phân tích mẫu:

Phân tích mẫu trong máy quang phổ UV-Vis đòi hỏi sự chú ý đặc biệt đến các điều kiện và vật liệu được sử dụng trong quá trình thí nghiệm. Mẫu chuẩn, hay còn gọi là "mẫu trắng," thường là một cuvet chứa dung môi tương tự như mẫu, và nó được sử dụng để đo lại các giá trị độ hấp thụ thực tế của chất phân tích. Trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn, chẳng hạn, môi trường nuôi cấy vô trùng sẽ là mẫu tham chiếu.

Để đảm bảo độ chính xác của phép đo, việc hiểu rõ về vật liệu của cuvet là quan trọng. Cuve bằng nhựa, ví dụ, thường không thích hợp cho các nghiên cứu hấp thụ tia cực tím vì chúng có thể hấp thụ tia cực tím. Kính, mặt khác, có thể hoạt động như một bộ lọc, hấp thụ một phần lớn UVC và UVB nhưng vẫn cho phép một số tia UVA đi qua. Thạch anh thường được sử dụng trong việc kiểm tra tia cực tím, vì nó là vật liệu trong suốt đối với phần lớn ánh sáng tia cực tím.

Người giữ mẫu thạch anh thường được sử dụng để kiểm tra tia cực tím, đảm bảo rằng sự hấp thụ được đo là chính xác và không bị nhiễm từ vật liệu giữ mẫu. Một số hệ thống không sử dụng cuvet, đặc biệt được thiết kế cho phân tích các thể tích mẫu nhỏ, chẳng hạn trong phân tích DNA hoặc RNA.

Phát hiện

Sau khi ánh sáng đi qua mẫu, một máy dò được sử dụng để chuyển đổi ánh sáng thành tín hiệu điện tử có thể đọc được. Các máy dò này thường dựa trên lớp phủ quang điện hoặc chất bán dẫn. Lớp phủ quang điện tạo ra dòng điện tỉ lệ với cường độ ánh sáng chiếu vào. Một ống nhân quang (PMT) là một loại máy dò phổ biến, dựa trên hiệu ứng quang điện để tạo ra dòng điện lớn từ sự tương tác của ánh sáng và chất phát quang. PMT đặc biệt hữu ích cho việc phát hiện mức độ ánh sáng rất thấp, cung cấp độ nhạy cao trong các phép đo quang phổ UV-Vis.

Sơ đồ hệ thống quang phổ UV-Vis dựa trên cuvet


Sơ đồ của một hệ thống quang phổ UV-Vis không có cuvet


Ưu điểm của quang phổ UV - VIS

Không có kỹ thuật nào là hoàn hảo và quang phổ UV ‑ Vis cũng không ngoại lệ. Tuy nhiên, kỹ thuật này có một số điểm mạnh chính được liệt kê dưới đây khiến nó trở nên phổ biến.

- Không Phá Hủy: Quang phổ UV-Vis không gây tổn thương mẫu, cho phép sử dụng lại mẫu hoặc thực hiện các bước xử lý và phân tích thêm.

- Phép Đo Nhanh Chóng: Các phép đo có thể được thực hiện nhanh chóng, dễ dàng tích hợp vào các giao thức thử nghiệm.

- Dễ Sử Dụng: Các công cụ đơn giản và dễ sử dụng, không đòi hỏi nhiều đào tạo trước khi sử dụng.

- Xử Lý Dữ Liệu Đơn Giản: Phân tích dữ liệu thường đòi hỏi ít bước xử lý, giảm đào tạo người dùng.

- Chi Phí Hợp Lý: Thiết bị không đắt, giúp nhiều phòng thí nghiệm có thể tiếp cận.

- Tuy nhiên, cũng có một số điểm yếu cần lưu ý:

- Ánh Sáng Lạc Hướng: Các bộ chọn bước sóng không hoàn hảo và ánh sáng từ dải bước sóng rộng có thể truyền vào, tạo ra sai số đo. Ánh sáng lạc cũng có thể đến từ môi trường hoặc bộ phận lỏng lẻo trong thiết bị.

- Tán Xạ Ánh Sáng: Chất rắn lơ lửng trong mẫu chất lỏng có thể gây tán xạ ánh sáng, dẫn đến kết quả không chính xác.

- Giao Thoa Từ Nhiều Loài Hấp Thụ: Các chất khác nhau trong mẫu có thể tạo ra phổ chồng lên nhau, đòi hỏi tách chúng ra và kiểm tra riêng lẻ.

- Cân Nhắc Về Mặt Hình Học: Vị trí không chính xác của các bộ phận trong thiết bị có thể dẫn đến kết quả không chính xác, đặc biệt là cuvet giữ mẫu. Cân nhắc về mặt hình học và đào tạo người dùng là quan trọng để tránh sai sót.

Công dụng thực tế của quang phổ UV -VIS

Phân Tích Dược Phẩm:

Quang phổ UV-Vis được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực dược học. Sử dụng các phương pháp toán học, quang phổ có thể giúp phân giải các đỉnh hấp thụ chồng lên nhau trong phổ gốc, giúp xác định các hợp chất dược phẩm riêng lẻ. Ví dụ, việc đồng thời xác định benzocaine, chất gây tê cục bộ, và chlortetracycline, một loại kháng sinh, trong các công thức bột thú y thương mại, là một ứng dụng điển hình. Các phương pháp này cho phép định lượng chính xác ở dải nồng độ microgam trên mililit, đồng thời xây dựng hàm hiệu chuẩn cho từng chất.

Nuôi Cấy Vi Khuẩn:

Trong lĩnh vực nuôi cấy vi khuẩn, quang phổ UV-Vis thường được sử dụng để đo mật độ quang học (OD) của các mẫu. Đo OD thường xuyên và nhanh chóng ở bước sóng 600 nm giúp ước tính nồng độ tế bào và theo dõi sự phát triển của chúng. 600 nm được ưa thích vì đặc tính quang học của môi trường nuôi cấy vi khuẩn và để tránh làm hỏng tế bào trong quá trình đo.

Phân Tích Đồ Uống:

Xác định chính xác các hợp chất trong đồ uống là một ứng dụng phổ biến khác của quang phổ UV-Vis. Đo hàm lượng caffeine, kiểm soát chất lượng của các chất màu như anthocyanin trong rượu vang thông qua việc khớp với bước sóng hấp thụ đã biết, là những ứng dụng thực tế trong ngành thực phẩm và đồ uống.

Quang phổ UV-Vis còn có nhiều ứng dụng khác trong nhiều ngành công nghiệp. Đối với dầu máy biến áp, việc đo chỉ số màu giúp theo dõi sự biến đổi màu sắc như một biện pháp phòng ngừa. Trong xử lý nước thải, quang phổ có thể được sử dụng để giám sát quá trình loại bỏ các chất nhuộm hoặc sản phẩm nhuộm. Nó cũng được sử dụng để kiểm tra độ xác thực của thực phẩm và giám sát chất lượng không khí. Các ứng dụng đặc biệt khác bao gồm theo dõi cấu trúc protein, xác định thành phần pin, và xác định đặc tính của các hạt nano rất nhỏ.

Như vậy, EMIN đã chia sẻ cho các bạn về cách hoạt động của quang phổ UV -VIS, phản ánh sự linh hoạt và hiệu quả trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Nếu thấy hay và bổ ích, bạn hãy theo dõi EMIN qua website và fanpage để cập nhật những tin tức mới nhất nhé