Kỹ Thuật PCR

I. NGUYÊN TẮC

PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction nghĩa là thử nghiệm nhân bản một đoạn DNA trong ống nghiệm dựa vào các chu kỳ nhiệt.

II. CHUẨN BỊ

1 Phương tiện, hóa chất

2 Máy luân nhiệt PCR

3 Máy chụp gen

4 Máy điện di

5 Máy ly tâm Eppendorf 10.000

6 Máy lắc có điều chỉnh nhiệt độ

7 Máy khuấy từ

8 Máy trộn vortex

9 Máy đo pH

10 Cân điện tử

11 Tủ lạnh 4oC, - 20oC và – 80oC

12 Tủ ấm

13 Ống hút

14 Đầu tuýp các cỡ

15 Ống Eppendorf các cỡ: 0,2; 0,5; 1,5ml

16 Găng tay các loại, khẩu trang, mũ, áo choàng, kính bảo hộ.

17 NaCl 0,09%

18 Kit tách chiết DNA

19 Dung dịch đệm

20 Nước cất

21 Thạch điện di (electrophoresis agar)

22 Thang chuẩn DNA 100bp

23 Ethidiumbromide

24 Chứng dương

25 Chứng âm

26 Đèn cực tím

27 Enzym polymerase chịu nhiệt, thường được gọi là Taq polymerase, có hoạt tính tối đa ở 72°C và bền được với nhiệt độ.

28 4 loại desoxyribonucleotid (dNTP) là Adenin, Thymin, Guanin và Cystosin (dATP, dTTP, dGTP, dCTP).

29 DNA chứa các đoạn DNA đích sẽ được nhân bản trong ống phản ứng.

30 Các đoạn mồi (primer) xuôi và ngược là các đoạn oligonucleotid có chiều dàikhoảng 20-30 nucleotid có trình tự bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự của hai đầu đoạn DNA sẽ được nhân bản.

31 Ion Mg  trong muối MgCl2 ở nồng độ thích hợp;

32 Dung dịch đệm Tris-KCl làm dung môi thích hợp cho phản ứng, khi ống nghiệm phản ứng này được cho vào buồng ủ chu kỳ của máy luân nhiệt.

III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

- Tách chiết DNA (RNA) khuôn mẫu: cách tách chiết DNA/RNA tùy thuộc vào loại mẫu, thường là lấy từ vật chủ tại nơi mà người lấy mẫu cho rằng có hiện diện của DNA tác nhân đích và do vậy cần lấy đúng chỗ. Thí dụ mẫu thử là vi khuẩn, người ta lấy 4-5 khuẩn lạc trộn đều với 200µl nước cất, đun cách thủy ở 950C trong 5 phút rồi ly tâm 10.000 vòng/phút x 2 phút và lấy dịch nổi làm khuôn mẫu DNA. Với mẫu mô sinh thiết, người ta tách chiết bằng phenol/clorofom (không dùng BOOM vì mẫu mô thường có nhiều DNA nên DNA đích không thể cạnh tranh để hấp phụ lên hạt silica và cũng không sử dụng BOOM cho tách chiết RNA).

- Đầu tiên, nhiệt độ được đưa lên 94°C, ở nhiệt độ này các liên kết hydro của mạch đôi DNA sẽ mất đi, nhờ vậy DNA đích bị biến tính thành các mạch đơn; giai đoạn nhiệt độ này được gọi là giai đoạn biến tính.

- Tiếp theo, nhiệt độ được hạ xuống 56°C-65°C là nhiệt độ thích hợp để các đoạn mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào hai đầu của đoạn DNA đích, giai đoạn này được gọi là giai đoạn bắt cặp.

- Cuối cùng, nhiệt độ được đưa lên 72°C là nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính của enzym Taq polymerase để kéo các dNTP lại đầu 3’ của đoạn mồi đang bắt cặp trên đầu 5’ của sợi DNA đích bắt nguồn cho sự tổng hợp nên mạch bổ sung. Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành 2 bản sao và nếu chu kỳ này lặp lại liên tục 30-40 lần thì từ một DNA đích đã nhân bản thành 230 đến 240 bản sao, nghĩa là hàng tỷ bản sao.

- Điện đi trên thạch (electrophoresis agar), nồng độ từ 1,5% -2% tùy theo kích thước đoạn gen nhân bản.

- Đọc kết quả trên thạch điện di trong buồng đọc dưới ánh sáng cực tím.

IV. KẾT QUẢ

- Các đoạn DNA được nhân bản theo yêu cầu.

V. NHỮNG SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ LÝ

- Mẫu phải lấy đúng vùng, đúng chỗ cần xác định sự hiện diện của DNA cần tìm.

-  Dụng cụ lấy bệnh phẩm và đồ dùng chứa bệnh phẩm phải đảm bảo tinh sạch về mặt sinh học, chỉ sử dụng một lần, nếu không sạch, các acid nucleic của tác nhân đích có trong mẫu sẽ bị phân hủy hay mẫu thử sẽ chứa các chất ức chế phản ứng khuyếch đại sau này.

- Tùy loại mẫu thử, tùy tác nhân đích là vi khuẩn, virus, nấm hay tế bào có nhân và tùy acid nhân phải tách chiết là DNA hay RNA để lựa chọn phương pháp tách chiết thích hợp. Nếu mẫu thử là mô sinh thiết, nên chọn phương pháp phenol/clorofom hơn là phương pháp BOOM.

- Cần kiểm tra bộ kit tách chiết có đảm bảo độ nhạy không trước khi thực hiện kỹ thuật.

- Ngăn ngừa nhiễm chéo và loại trừ ngoại nhiễm sản phẩm khuyếch đại.

- Chọn tỷ lệ % agarose phù hợp, tỷ lệ trung bình hay dùng là 2%, nhưng đối với các sản phẩm khuếch đại lớn > 500bps, nên dùng loại 1,5%, còn loại khuyếch đại < 100bps, nên dùng agarose > 2,5%.

- Cần tuyệt đối tuân thủ an toàn khi sử dụng ethidium bromid.

- Trong một số trường hợp, kỹ thuật không thực hiện được với những phân tử DNA có kích thước > 3kb. PCR cho kết quả tốt nhất ở DNA có độ dài < 1,5kb.

- Theo quy trình PCR gốc của Mullis, enzym phản ứng nhân bản DNA được thực hiện trong ống nghiệm (in vitro). Sợi DNA đôi bị tách thành 2 sợi đơn khi đun nóng ở 96°C. Tuy nhiên, ở nhiệt độ này, DNA polymerase bị phá hủy. Vì vậy, cần bổ sung enzym sau mỗi giai đoạn nung nóng của mỗi chu kỳ. Quy trình PCR gốc của Mullis không có hiệu quả cao vì nó mất nhiều thời gian, cần một lượng lớn DNA polymerase và phải liên tục lưu ý suốt quá trình thực hiện kỹ thuật.